. Deteksi Penyakit Virus pada Ikan dan Udang dengan Metode Polymerase Chain Reaction (PCR) di Laboratorium Kesehatan Ikan dan Lingkungan Pasuruan Jawa Timur

Dalam kegiatan budidaya salah satu kendala yang seringkali terjadi adalah penyakit infeksius yang disebabkan oleh virus. Pada padat penebaran ikan yang tinggi jika faktor lingkungan kurang menguntungkan misalnya kandungan zat asam dalam air rendah, pakan yang diberikan kurang tepat baik jumlah maupun mutunya, penanganan ikan kurang sempurna, maka ikan akan menderita stress. Dalam keadaan demikian ikan akan mudah terserang oleh penyakit (Snieszko, 1973 ; Sarig, 1971). Tindakan peringatan dini yang dapat dilakukan adalah dengan identifikasi virus pada ikan dan udang. Proses identifikasi virus menggunakan metode PCR (Polymerase Chain Reaction). Metode PCR telah banyak digunakan di laboratorium uji di Indonesia, metode ini dinilai efektif karena dapat diperoleh hasil dengan cepat dan tepat (Fitriatin dan Manan, 2015). Maksud pelaksanaan KPA yaitu mempelajari tahapan pengujian dan meningkatkan keterampilan untuk melakukan identifikasi penyakit virus pada ikan dan udang dengan metode PCR (Polymerase Chain Reaction) dengan tujuan akhir KPA mengidentifikasi gejala klinis serangan penyakit virus pada ikan dan udang,mengetahui jenis penyakit virus dan SOP identifikasi virus pada ikan dan udang dengan metode PCR dan mengidentifikasi hasil uji PCR dari sampel ikan dan udang. KPA ini dilaksanakan di UPT Laboratorium Kesehatan Ikan dan Lingkungan Pasuruan, pada tanggal 21 Maret 2022 sampai dengan 1 Juli 2022. Metode yang digunakan dalam pelaksanaan Kerja Praktik Akhir (KPA) ini adalah metode survei, metode observasi, metode wawancara dan metode observasi laboratorium. Sedangkan sumber data yang diambil adalah data primer dan data sekunder. Untuk mengetahui tahapan deteksi penyakit virus pada ikan dan udang, alat dan bahan pengujian yaitu menggunakan metode deskriptif. Selama pelaksanaan Kerja Praktik Akhir (KPA) didapatkan 33 sampel uji. Yang terdiri dari 11 sampel ikan nila, 2 sampel ikan bandeng, 1 sampel ikan koi, 1 sampel ikan komet, 6 sampel benur udang vannamei, 1 sampel naupli udang vannamei, 7 sampel udang vannamei dan 4 sampel udang windu. Proses deteksi penyakit virus pada ikan dan udang harus dilakukan dalam keadaan yang steril, agar terhindar dari kontaminasi dan agar hasil uji akurat. Deteksi penyakit virus ini terdiri dari beberapa tahap, antara lain nekropsi, amplifikasi, elektroforesis dan pembacaan hasil. Proses nekropsi pada sampel ikan dan udang dilakukan dengan cara yang sama, yaitu mengambil 0,2 gram sampel organ target. Organ target yang diambil berbeda antara sampel ikan dan udang, sesuai dengan jenis sampel dan jenis virus yang akan dideteksi. Proses ekstraksi pada sampel ikan dan udang menggunakan Extraction Kit (IQ PlusTM Extraction Kit). Proses ekstraksi dilakukan dengan cara menambahkan 500 µL solution 1 kedalam tube yang sudah berisi sampel. Kemudian sampel digerus dengan grinder sampai halus dan homogen. Setelah sampel halus, ditambahkan 500 µL solution 2, kemudian di vortex dan di sentrifugasi selama 1 menit. Kemudian ambil 500 µL supernatan dan masukkan kedalam tube filter dan disentrifugasi selama 1 menit. Kemudian supernatan pada tube filter dibuang dan ditambahkan solution 2 sebanyak 500 µL lalu di sentrifugasi selama 3 menit. Kemudian supernatant dibuang dan tube filter dipindahkan kedalam tube baru dan ditambahkan 200 µL solution 3, lalu disentrifugasi selama 1 menit. Langkah terakhir yaitu buang tube filter, supernantan yang ada pada tube baru merupakan asam nukleat yang siap untuk di amplifikasi. Dalam proses amplifikasi, dibedakan menjadi dua, yaitu amplifikasi RNA dan amplifikasi DNA. Amplifikasi RNA dilakukan untuk pengujian virus IMNV, TSV, VNN dan TiLV. Amplifikasi virus jenis RNA dilakukan dengan dua step, pada step 1 dinamakan RT-PCR , pada step ini dilakukan transkripsi balik (reverse transcriptase) mRNA menjadi cDNA. Karena amplifikasi hanya dapat berjalan untuk asam nukleat DNA. Setelah RT-PCR selesai, maka dilanjutkan step 2, yaitu nested. Dalam tahapan nested, terjadi proses amplifikasi yang sebenarnya yaitu penggandaan DNA yang meliputi proses denaturasi, annealing dan ekstensi. Amplifikasi DNA dilakukan dengan amplifikasi 2 step dan 1 step, tergantung Kit yang digunakan. Pada uji virus KHV hanya terdiri dari satu step, amplifikasi virus KHV menggunakan manual Kit yang terdiri dari beberapa reagen, antara lain 2xMyTaq HS Redmix, NFW, Primer F1 KHV dan primer R1 KHV. Sedangkan amplifikasi WSSV dilakukan dengan 2 step yang dinamakan nested-PCR. Amplifikasi virus WSSV menggunakan Kit IQ2000TM. Hasil amplifikasi kemudian dielektroforesis untuk menentukan ukuran basa DNA yang telah dihasilkan. Proses elektroforesis diawali dengan pembuatan gel agarose sebagai media elektroforesis. Pembuatan gel agaroses dilakukan dengan melarutkan bubuk agarose dengan buffer TAE, dipanaskan dan diberi 10µL sybr safe sebagai pewarna. Sementara menunggu larutan agarose dingin, bejana elektroforesis dipasang dan diberi sisir yang berfungsi untuk membentuk sumuran. Larutan gel agarose dituang kedalam bejana elktroforesis dan ditunggu hingga memadat. Setelah memadat, ditambahkan buffer TAE dan amplikon yang akan direaksikan dimasukkan kedalam sumuran dengan menggunakan mikropipet. Setelah itu, dihubungkan dengan elektroforesis supply dengan tegangan 120V, arus listrik 500 mA dan waktu 30 menit. Berjalannya elektroforesis ditandai dengan munculnya gelembung-gelembung. Hasil akhir, divisualisasikan dengan UV-Transiluminator.
Berdasarkan hasil Kerja Praktik Akhir, disimpulkan Gejala klinis infeksi virus terdapat pada sampel uji WSSV dengan kode sampel 644, 646 dan 650, yaitu tubuh udang terlihat pucat dan kemerahan. Gejala klinis infeksi virus IMNV terdapat pada sampel uji dengan kode sampel 638, yaitu tubuh udang memutih, kemerahan pada ekor seperti udang rebus, deteksi penyakit virus di UPT Laboratorium Kesehatan Ikan dan Lingkungan Pasuruan meliputi proses nekropsi, ekstraksi, amplifikasi, elektroforesis dan pembacaan hasil menggunakan UV transiluminator. Jenis penyakit virus pada ikan dan udang yang di uji di UPT Laboratorium Kesehatan Ikan dan Lingkungan Pasuruan adalah VNN, TiLV, KHV, Iridovirus, WSSV, IMNV,TSV dan IHHNV, hasil analisis PCR 1 sampel positif IMNV pada 139bp dan 3 sampel WSSV pada 296bp, 550bp dan 910bp. Dengan saran, Pembaruan peralatan, seperti thermo bath yang sudah error agar tidak menghambat proses proses pengujian dan perbaikan proses pembuangan limbah, serta pemusnahan sampel, agar tidak berbahaya bagi lingkungan sekitar.

DAFTAR PUSTAKA
Fitriatin, E dan Manan, A. 2015. Pemeriksaan Viral Nervous Necrosis (VNN) pada Ikan dengan Metode Polymerase Chain Reaction (PCR). Jurnal Ilmiah Perikanan dan Kelautan. 7(2) : 149-152.
Sarig, S. (1971). Penyakit Ikan. Buku 3: Pencegahan dan Pengobatan Penyakit warmwater Ikan di bawah ketentuan Subtropical, dengan Penekanan khusus pada Pertanian Ikan Intensif
Sniezko S. 1973. Recent advances in scientific knowledge and developments pertaining to diseases of fish. Advances in Veterinary Science and Comparative Medicine, 17, 291-314.